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支原體高靈敏度試劑盒規(guī)范的操作流程分享

發(fā)布時間： 2025-09-10　　點擊次數(shù)： 812次

　　在細(xì)胞培養(yǎng)、生物制藥與臨床診斷領(lǐng)域，支原體污染是威脅產(chǎn)品質(zhì)量與實驗結(jié)果的原因。支原體高靈敏度試劑盒憑借PCR或酶聯(lián)免疫等技術(shù)，可檢測低濃度的支原體DNA或抗原。其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性高度依賴于規(guī)范的操作流程。掌握支原體高靈敏度試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)使用方法，是確保警報真實可靠的關(guān)鍵。

　　第一步：環(huán)境準(zhǔn)備與試劑預(yù)處理
　　在獨立的潔凈區(qū)（如生物安全柜）進行操作，避免交叉污染。將試劑盒從-20℃冰箱取出，室溫（15-25℃）平衡15-30分鐘。檢查各組分是否齊全、無破損、無污染。嚴(yán)禁反復(fù)凍融試劑，使用后立即放回低溫保存。準(zhǔn)備好無菌離心管、移液器及濾芯吸頭。
　　第二步：樣本采集與處理
　　細(xì)胞培養(yǎng)液：取1-5mL上清液，4℃10,000×g離心5-10分鐘，棄沉淀，取上清用于檢測；
　　血清/生物制品：直接取樣或按比例稀釋；
　　組織樣本：勻漿后離心取上清。
　　所有操作需無菌進行，防止外源DNA/RNA污染。樣本應(yīng)新鮮或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。
　　第三步：反應(yīng)體系配制
　　根據(jù)說明書計算所需反應(yīng)液總量（陰性對照、陽性對照、待測樣本）。在冰上解凍引物、探針、酶混合液。使用單通道或多通道移液器，按順序加入緩沖液、酶、引物等，輕輕混勻，短暫離心去除氣泡。每批次必須包含陰性與陽性對照，以驗證實驗有效性。
　　第四步：加樣與擴增/孵育
　　將配制好的反應(yīng)液分裝至PCR管或微孔板。依次加入處理后的樣本、陰性對照、陽性對照（各10-20μL），蓋緊管蓋或封板膜。放入實時熒光PCR儀或酶標(biāo)儀，設(shè)置正確的程序：
　　PCR法：預(yù)變性→40個循環(huán)（變性-退火-延伸）→熔解曲線分析；
　　ELISA法：37℃孵育30-60分鐘→洗板→加酶標(biāo)抗體→再孵育→顯色→終止。嚴(yán)格控制溫度與時間。
　　第五步：結(jié)果判讀與記錄
　　PCR法：觀察擴增曲線是否呈“S”型，Ct值是否在有效范圍。陽性樣本Ct≤35且熔解曲線峰形正確；陰性對照無擴增；陽性對照有擴增。
　　ELISA法：用酶標(biāo)儀讀取OD值，計算樣本與臨界值（CO）的比值（S/CO）。S/CO≥1.0判為陽性。
　　記錄所有數(shù)據(jù)，保存原始圖譜或OD值表格，建立檢測檔案。

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